Peter Sarnow tərəfindən redaktə edilmişdir, Stanford Universiteti Tibb Məktəbi, Stanford Universiteti, Kaliforniya, 25 dekabr 2020-ci ildə təsdiq edilmişdir (25 oktyabr 2020-ci ildə nəzərdən keçirilmişdir)
Replikasiya və təkamül mühafizəsi üçün vacib olan koronovirusların-transkripsiya komplekslərinin təkrarlanmasında alt bölmələr arasında qarşılıqlı əlaqə haqqında məlumat veririk.Nsp12 ilə əlaqəli NiRAN domeninin transda nukleozid monofosfat (NMP) transferaz aktivliyinə malik olduğuna dair sübut təqdim etdik və onun hədəfi kimi nsp9 (RNT bağlayan protein) təyin etdik.NiRAN, Mn2+ ionlarına və bitişik qorunan Asn qalıqlarına əsaslanan reaksiyada NMP hissəsinin qorunan nsp9 amin terminalına kovalent bağlanmasını katalizləyir.Məlum olub ki, NiRAN aktivliyi və nsp9 NMPylation koronavirusun təkrarlanması üçün vacibdir.Məlumatlar bizə yuvalanmış virus ferment markerinin bu fəaliyyətini RNT virusları sinfində RNT sintezinin başlanmasının funksional və təkamül baxımından ardıcıl olması fərziyyəsində əvvəlki müşahidələrlə əlaqələndirməyə imkan verir.
Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae və digər 12 ailə) RNT-dən asılı RNT polimerazı (RdRps) NiRAN adlanan poliproteindən ayrılan qeyri-struktur zülalda (nsp) amin-terminal (N-terminal) domeninə bağlıdır. 1ab viral əsas proteazdan (Mpro) ibarətdir.Əvvəllər, arterial virus NiRAN-RdRp nsp-nin öz GMPylation/UMPylation fəaliyyəti haqqında məlumat verilmişdi və nukleozid monofosfatın (NMP) virusa və/və ya hüceyrə biopolimerləşməsinə ötürülməsi üçün keçidin yaradılması təklif edilmişdir.Burada göstəririk ki, koronavirus (İnsan Koronavirusu [HCoV]-229E və Ağır Kəskin Tənəffüs Sindromu Koronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mpro-vasitəçiliyi ilə nsp9 meydana gəlməsi ilə nsp9-dan əldə edilən Mn2+-dan asılı NMPyasiya aktivliyinə malikdir. N-terminal yan nsps proteolitik olaraq ayrılır, fosforamidat nsp9-un N-terminalında əsas aminə (N3825) bağlanır.Uridin trifosfat bu reaksiyada üstünlük verilən nukleotiddir, lakin adenozin trifosfat, guanozin trifosfat və sitidin trifosfat da uyğun ko-substratlardır.Rekombinant coronavirus nsp9 və nsp12 zülallarından və genetik olaraq hazırlanmış HCoV-229E mutantlarından istifadə edilən mutasiya tədqiqatları hüceyrə mədəniyyətində NiRAN vasitəçiliyi ilə nsp9 NMPilasiyası və virus replikasiyası üçün lazım olan qalıqları təyin etdi.Məlumatlar NiRAN aktiv sayt qalıqlarının proqnozunu təsdiqlədi və nsp9 N3826 qalıqlarının nsp9 NMPylation və in vitro virus replikasiyasında mühüm rolunu müəyyən etdi.Bu qalıq konservləşdirilmiş N-terminal NNE tripeptid ardıcıllığının bir hissəsidir və koronavirus ailəsində nsp9 və onun homoloqlarının yeganə invariant qalığı olduğunu sübut etdi.Bu tədqiqat digər yuvalanmış virusların NMPylation fəaliyyətinin funksional tədqiqi üçün möhkəm zəmin yaradır və antiviral dərmanların inkişafı üçün mümkün hədəfləri təklif edir.
Nidovirales müsbət zəncirli RNT virusu müxtəlif onurğalı və onurğasızları yoluxdurur (1, 2).Sifariş hazırda 14 ailəni (3) əhatə edir ki, bunlardan da Koronavirus ailəsi son 20 ildə geniş şəkildə tədqiq edilib.O dövrdə heyvan sahiblərindən üç zoonotik koronavirus ortaya çıxdı və insanlarda ağır tənəffüs yoluxucu infeksiyaların geniş miqyaslı yayılmasına səbəb oldu.O cümlədən ağır kəskin yoluxucu xəstəliklərin səbəb olduğu davamlı pandemiyalar.Tənəffüs Sindromu Koronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidoviruslar ümumi genom təşkilatını bölüşürlər və membranla əlaqəli replikasiya-transkripsiya kompleksinin (RTC) alt bölməsi 5-?²-terminalın üçdə ikisində və virus hissəciyinin əsas struktur alt bölməsində, həmçinin bəzi aksessuarlarda kodlanır. .Protein, genomun 3??² son üçdə kodlanmışdır (1).Planar virusların bir ailəsi (Monoviridae) (8) istisna olmaqla, bütün iç-içə viruslar RTC alt bölmələrini iki böyük açıq oxu çərçivələrində (ORF) ORF1a və ORF1b kodlayır, bunlar genomik RNT-dən tərcümə olunur.ORF1a poliproteini (pp) 1a kodlayır və ORF1a və ORF1b birlikdə pp1ab-ı kodlayır.ORF1a tərəfindən kodlanan əsas proteazanın (Mpro) ümumi iştirakı ilə həm pp1a, həm də pp1ab proteolitik olaraq müxtəlif struktur olmayan zülallara (nsps) emal olunur, 3CLpro kimi də tanınır, çünki o, pikornavirusun 3Cpro ilə homologiyaya malikdir. 9).Bu nsps-lərin böyük bir dinamik RTC-yə yığıldığı, genomik RNT (replikasiya) və bir sıra subgenomik RNT (transkripsiya) sintezini katalizlədiyi düşünülür və ORF1b-nin aşağı axınında yerləşən ORF-nin ifadəsini əlaqələndirmək üçün istifadə olunur (10? ?12).
Əsas RTC-yə RNT-dən asılı RNT polimeraza (RdRp) (13), superfamily 1 helikaz (HEL1) (14, 15) və əsasən ORF1b-də və koronavirus ailəsində kodlanmış bir neçə RNT emal fermenti daxildir. Arterioviridae ailəsində nsp9-nsp12 (bax 10ââ 12).RdRp və HEL1 quş yuvası virusunun iki (beşdə biri) qorunan domenini təmsil edir və digər RNT virusları arasında homologiyaya malikdir.Əsas replikaza digər alt bölmələrin, o cümlədən pp1a-nın karboksi-terminal (C-terminal) bölgəsindən, Mpro-nun aşağı axınından ayrılan bir neçə kiçik nsps (müvafiq olaraq coronavirus nsp5 və arterial virus nsp4) tərəfindən kömək edildiyi güman edilir.Onların məhdud ailə mühafizəsi və müxtəlif fəaliyyətləri var (10ââ12-də nəzərdən keçirilir).
Nisbətən yaxınlarda, bütün yuvalanmış viruslarda RdRp-ə bitişik amin terminalında (N-terminus) unikal ardıcıllıq motiv xüsusiyyətlərinə malik bir domen tapıldı, lakin başqa RNT virusları yoxdur (16).Yerləşdiyi yerə və nukleotid transferaza (nukleozid monofosfat [NMP] transferaza) fəaliyyətinə əsasən, bu domen NiRAN (Nestvirus RdRp ilə əlaqəli nukleotid transferaz) adlandırılır.NiRAN-RdRp-nin ikili domenli kombinasiyası Coronaviridae ailəsində nsp12 və Arterioviridae ailəsində nsp9 təşkil edir və digər nestoviridaelərdə NiRAN-RdRp-nin viral poliproteindən müstəqil nsp kimi buraxılması gözlənilir.Koronavirusda NiRAN domeni ?1/450 qalıqları ehtiva edir və əlaqələndirici bölgə (16?19) vasitəsilə C-terminal RdRp domeninə qoşulur.At Arterit Virusunda (EAV) (Arteriviridae) rekombinant nsp9 Mn2+ iondan asılı (öz-özünə) UMPylation və GMPylation fəaliyyətlərini göstərir ki, bu da nestovirusda, AN, BN və CN-də üç qorunmuş ardıcıllıq əsasından asılıdır, ardıcıllıqdakı qalıqlar.Burada N NiRAN deməkdir) (16).Bu motivlərin N-terminal cinahı daha az mühafizəkar preAN motividir.Bu qalıqların bəziləri həm də uzaqdan əlaqəli zülal kinazlarında saxlanılır, burada onların nukleozid trifosfat (NTP) bağlanmasında və katalitik fəaliyyətdə iştirak etdikləri göstərilmişdir (20, 21).Bu müşahidəyə uyğun olaraq, Pseudomonas syringae-dən olan psevdokinaz SelO-da bir neçə əsas aktiv sahə qalıqları bu yaxınlarda dərc edilmiş SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkompleksi ilə yığıla bilər.Konservləşdirilmiş Coronavirus NiRAN qalıqları elektron mikro strukturunda üst-üstə düşür.Rekombinant protein (17).Sənədləşdirilmiş (öz-özünə) U/GMPylation NMP-ni (hazırda naməlum) substrata ötürmək üçün keçici bir vəziyyət yaradacağı güman edilir (16) və NiRAN və protein kinaz arasındakı struktur oxşarlıq (17, 19) ) Bu fərziyyə budur ki, NiRAN digər zülalları dəyişdirir.
Bir çox xüsusiyyətlər, o cümlədən yuvalanmış viruslarla unikal və unikal sistematik əlaqəsi və RdRp-dən genetik ayrılması, NiRAN-ı onların yaranması və şəxsiyyəti üçün kritik olan yuvalanmış viruslar üçün ağlabatan əsas tənzimləyici fermentə çevirir.Əvvəllər, genom/subgenomik tərcümə və ya replikasiya/transkripsiyanı tənzimləmək üçün NiRAN-ı əhatə edən üç mümkün funksiya çağırılırdı.O dövrdə mövcud olan az və natamam məlumatları nəzərə alsaq, hər bir funksiyanın öz üstünlükləri və mənfi cəhətləri var (16).Bu araşdırmada biz iki nəsli təmsil edən koronavirusların biokimyəvi və tərs genetik tədqiqatlarını birləşdirməyi və bu Sirli aləm haqqında fikir əldə etmək üçün tapıntılarımızı koronavirus ailəsinin təbii mutasiyasının təkamül fonunda yerləşdirməyi hədəfləyirik.Biz RTC-də təbii hədəflərin müəyyən edilməsi yolu ilə NiRAN-ın başa düşülməsində böyük irəliləyişlər barədə məlumat veririk ki, bu da (mövcud üç fərziyyə arasında) bu domenin yuvalanmış virus RNT-nin sintezinin başlanmasında roluna töhfə verir.Bu tədqiqat həm də virus host interfeysində NiRAN-ın digər rolları üçün imkanlar açır.
Korona virusu nsp12 ilə əlaqəli NiRAN domeninin fermentativ xassələrini xarakterizə etmək üçün biz E. coli-də insan koronavirusu 229E (HCoV-229E) nsp12-nin C-terminusunda His6 etiketi olan rekombinant formasını istehsal etdik və onları birləşdirdik. [α32-P ] ilə zülal Materiallar və Metodlarda təsvir olunduğu kimi MnCl2 varlığında NTP ilə birlikdə inkubasiya edin.Reaksiya məhsulunun təhlili nsp12 (106 kDa) ilə birgə miqrasiya edən radio-etiketli zülalın mövcudluğunu göstərdi ki, bu da koronavirus nsp12-nin uridin monofosfat (UMP) ilə üstünlük təşkil edən kovalent zülal-NMP əlavələrinin əmələ gəlməsini kataliz etdiyini göstərir (Şəkil 1A) Və B).Kəmiyyət təhlili göstərdi ki, digər nukleotidlərlə müqayisədə UMP birləşməsinin siqnal intensivliyi 2-3 dəfə artıb (Şəkil 1C).Bu məlumatlar koronavirusun NiRAN domeninin proqnozlaşdırılan NMP transferaz aktivliyinə uyğundur (16), lakin koronavirusun və arterial virusun NiRAN domeninin nukleotid üstünlüklərinin fərqli olduğunu göstərir.
HCoV-229E nsp12-nin özünü NMPilasiya fəaliyyəti.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) təyin olunmuş [α-32P] NTP ilə 6 mM MnCl2 varlığında 30 dəqiqə inkubasiya edildi (ətraflı məlumat üçün Materiallar və Metodlara baxın).Reaksiya məhsulları SDS-PAGE ilə ayrıldı və Coomassie parlaq mavi ilə boyandı.(B) Radiolabeled zülal fosfor görüntüləmə ilə görüntülənir.Nsp12-His6 və protein molekulyar kütlə markerlərinin mövqeləri (kilodaltonlarla) A və B-də göstərilmişdir. (C) Radioaktiv siqnalın intensivliyi (orta ± SEM) üç müstəqil təcrübədən müəyyən edilmişdir.*P≤0,05.Siqnal gücü (faiz) UTP ilə bağlıdır.
NiRAN ilə əlaqəli ferment fəaliyyətlərinin hüceyrə mədəniyyətində EAV və SARS-CoV replikasiyası üçün vacib olduğu göstərilsə də (16), spesifik NiRAN funksiyası və potensial hədəflər hələ müəyyən edilməmişdir.NiRAN və zülal kinaza bənzər qıvrımları olan zülallar ailəsi arasında bu yaxınlarda bildirilən struktur oxşarlığı (17, 22) bizi NiRAN-ın digər zülalların NMPilasiyasını katalizlədiyi fərziyyəsini sınaqdan keçirməyə vadar etdi.HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) ilə kodlanmış qeyri-struktur zülallar da daxil olmaqla, hər birində C-terminal His6 etiketi (SI əlavəsi, Cədvəl S1) olan bir sıra potensial homoloji hədəflər yaratdıq. bu zülalları [α32-P] uridin trifosfat ([α32-P]UTP) ilə nsp12-nin mövcudluğu və ya olmaması ilə inkubasiya edin.E. coli-də istehsal olunan iribuynuzlu zərdab albumini və MBP-LacZα füzyon proteini nəzarət elementi kimi xidmət etmişdir (Şəkil 2A, 1-dən 7-ə qədər zolaqlar).Radioaktiv etiketli zülal natrium dodesil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) və avtoradioqrafiya ilə təhlil edilmiş və nsp12 və nsp9 ehtiva edən reaksiyada güclü radioaktiv siqnalın olduğu müəyyən edilmişdir.Siqnalın mövqeyi nsp9-un molekulyar kütləsinə uyğundur, bu da nsp9-un nsp12 vasitəçiliyi ilə UMPilasiyasını göstərir (Şəkil 2B, track 7).Başqa heç bir test zülalının UMPyated olmadığı aşkar edilmədi, bu da bizi nsp9-un nsp12-nin xüsusi substratı olduğu qənaətinə gətirdi.Şəkil 1-də göstərilən öz-NMPylation məlumatlarına uyğun olaraq, nsp12 bütün dörd NMP-ni nsp9-a ötürə bilir, baxmayaraq ki, effektivlik fərqlidir, UMP> adenozin monofosfat (AMP)> guanozin monofosfat (GMP)> sitidin monofosfat (CMP) ) ( Şəkil).3 A və B).Bu analizdə istifadə olunan şərtlərdə (reaksiya və məruz qalma müddətini qısaltmaq, nsp12-nin konsentrasiyasını azaltmaq; materiallar və üsullar) nsp12-nin öz-özünə NMPilasiyası aşkar edilə bilməz (Şəkil 2B, zolaq 7 və Şəkil 1B ilə müqayisə edin), hansı UMP-nin nsp12-dən nsp9-a köçürülməsinin effektiv (Və çoxlu raund) olduğunu sübut etdi.UMP transferaz aktivliyi Şəkil 3C-də göstərildiyi kimi Mn2+ ionlarının olmasını tələb edir, Mg2+ olduqda isə yalnız minimal UMP transferaza aktivliyi müşahidə olunub və sınaqdan keçirilmiş digər iki ikivalentli kationların iştirakı ilə heç bir aktivlik müşahidə edilməyib.Oxşar məlumatlar sitidin trifosfat (CTP), guanozin trifosfat (GTP) və adenozin trifosfat (ATP) olan NMPylation analizlərində əldə edilmişdir (SI əlavəsi, Şəkil S1).
HCoV-229E nsp9-un nsp12 vasitəçiliyi ilə UMPilasiyası.HCoV-229E nsp12-His6⁺ vasitəçiliyinin UMPylation fəaliyyətini qiymətləndirmək üçün bir sıra zülal substratları (buvar serum albumini, MBP-lacZα və ORF1a tərəfindən kodlanmış C-terminal His6 ilə etiketlənmiş bir sıra HCoV-229E nsps daxil olmaqla) istifadə edilmişdir. protein.Materiallarda və üsullarda təsvir olunduğu kimi nsp12 (A) və ya mövcudluğu (B) olmadıqda zülalı [α-32P] UTP ilə 10 dəqiqə inkubasiya edin.A və B-nin yuxarı hissəsində Coomassie Brilliant Blue ilə boyanmış SDS-poliakrilamid gel, A və B-nin aşağı hissəsində isə müvafiq avtoradioqramlar göstərilir.Zülalın molekulyar kütləsi markerinin mövqeyi (kilodaltonlarla) solda verilmişdir.nsp12-His6 (B, yuxarı) mövqeyi və nsp12-His6-nın nsp9-His6 (B, zolaq 7) ilə inkubasiyası zamanı müşahidə olunan radioaktiv siqnal da göstərilir ki, bu da [α-32P]UMP-nin nsp9-His6-ya (12.9 kDa), sınaqdan keçirilmiş digər zülallar üçün müşahidə edilməmişdir.
HCoV-229E NiRAN vasitəçiliyi ilə nsp9 NMPilasiyasının biokimyəvi və virusoloji xarakteristikası.(A və B) Reaksiyada istifadə olunan nukleotid ko-substratının rolu.Nsp12-His6 və nsp9-His6 standart NMPylation analizində müxtəlif [α-32P] NTP-lərin iştirakı ilə qarışdırılır və inkubasiya edilir.(A, yuxarı) SDS-PAGE ilə ayrılmış Coomassie ilə boyanmış nsp9-His6.(A, alt) Gelin eyni sahəsinin avtoradioqrafı.(B) Təyin edilmiş nukleotid kofaktorunun iştirakı ilə nisbi aktivlik (orta ± SEM) üç müstəqil təcrübədən müəyyən edilir.*P≤0,05.(C) Metal ionlarının rolu.[α-32P] UTP və hər biri 1 mM konsentrasiyası olan müxtəlif metal ionlarının iştirakı ilə standart NMPylation testi göstərilir.C-də yuxarıda Coomassie ilə boyanmış nsp9-His6, C-də isə aşağıda müvafiq avtoradioqrafiya göstərilir.Etiketlənmiş zülalın ölçüsü (kilodaltonla) A və C-nin solunda göstərilir. (D) HCoV-229E nsp12-His6-nın müəyyən edilmiş amin turşusu əvəzetməsini daşıyan mutant forması təsvir olunduğu kimi [α-32P]UTP-dədir. Materiallar və Metodlar.NMPylation reaksiyasında istehsal olunan radioetiketli nsp9-His6 fosforilasiya görüntüsü ilə aşkar edilir (D, yuxarı).Yabanı tipli (ağırlıq) zülal ilə müqayisədə nisbi aktivlik D-də göstərilib və aşağı üç Müstəqil təcrübədən orta (±SEM) kimi götürülür.Ulduzlar qorunmayan qalıqların əvəzlənməsini göstərir.(E) infeksiyadan 24 saat sonra əldə edilən p1 hüceyrələrinin mədəniyyət supernatantında virus titri lövhə analizi ilə müəyyən edilmişdir.Mühəndisləşdirilmiş HCoV-229E mutantının NiRAN domenində kodon əvəzetmələri göstərilmişdir (qalıq nömrələnməsi onların pp1ab-dakı mövqeyinə əsaslanır).Replikasiya çatışmazlığı olan RdRp aktiv sayt mutant nsp12_DD4823/4AA nəzarət kimi istifadə edilmişdir.
NiRAN-ın aktiv sahəsini daha dərindən başa düşmək və nsp9-spesifik NMP transferazanın fəaliyyəti ilə bağlı qalıqları müəyyən etmək üçün biz mutasiya analizi apardıq, burada NiRAN AN, BN və CN motivlərində konservativ qalıqları əvəz etdik ( 16) Ala (SI əlavəsi, Şəkil S2).Bundan əlavə, mühafizəkar Arg-to-Lys və ya Lys-to-Arg əvəzetmələrinin təsiri iki halda qiymətləndirilmişdir.(Mənfi) nəzarət olaraq, koronavirusların və digər yuvalanmış virusların NiRAN domenində qorunmayan və ya daha az qorunan qalıqlar Ala ilə əvəz olunur. K4116A (preAN motivində), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif) ilə əvəz olunur. BN) və D4280A (CN) nsp12 vasitəsilə nsp9 NMPilasiyasını əhəmiyyətli dərəcədə azaldır və ya hətta aradan qaldırır, konservativ əvəzediciləri (R4178K), K4116R) olan zülallar isə aktivliyinin 60% və 80%-ni saxlayır, bu da onların müvafiq tərəflərindəki məhdudiyyətlərin yumşaldılmasını göstərir. zəncirlər fiziki-kimyəvi cəhətdən həssasdır (Şəkil 3D).E4145A, D4273A, F4281A və D4283A bir neçə digər qorunan qalıqları əvəz etmək daha az zərərlidir və nsp9 UMPylation yalnız orta dərəcədə azalır.Oxşar nəticələr digər NTP-ləri əhatə edən nsp9 NMPylation reaksiyalarında (Şəkil 3D və SI əlavəsi, Şəkil S3) əldə edilmişdir ki, bu da xüsusi amin turşusu əvəzetmələrinə müşahidə edilən təsirlərin istifadə edilən nukleotid ko-substratının növündən asılı olmadığını təsdiqləyir.Sonra, bu nsp12 əvəzetmələrinin hüceyrə mədəniyyətində koronavirusların təkrarlanmasına mümkün təsirini sınaqdan keçirdik.Bu məqsədlə, biz 5-7 hüceyrəni transkripsiya etmək üçün rekombinant vaksin virusunda (23, 24) klonlaşdırılmış müvafiq genetik cəhətdən hazırlanmış tamamlayıcı DNT (cDNA) şablonlarından istifadə etdik.Bu hüceyrələrdə istehsal edilən yoluxucu virus nəslinin titrasiyası göstərdi ki, HCoV-229E NiRAN mutantlarının əksəriyyəti mümkün deyil (Şəkil 3E).Həyat qabiliyyəti olmayan viral mutantlar qrupuna in vitro NMP transferaz fəaliyyətini aradan qaldıran və ya əhəmiyyətli dərəcədə azaltdığı sübut edilmiş alternativlər daxildir (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), lakin daha iki alternativ var (K4116R, E4805A) % qorunur?Onların in vitro NMPylation fəaliyyəti əlavə məhdudiyyətlərin iştirak etdiyini göstərir.Eynilə, NiRAN-ın in vitro NMPylation fəaliyyətinin orta dərəcədə azalmasına səbəb olan digər iki mutasiya (R4178K, F4281A) canlı viruslar əmələ gətirdi, lakin bu viruslar replikasiya vasitəsilə titrləri əhəmiyyətli dərəcədə azaldıb.Şəkil 3D-də göstərilən in vitro fəaliyyət məlumatlarına uyğun olaraq, koronavirus və/və ya digər yuvalanmış viruslarda (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) qorunmayan dörd digər qalığı əvəz edərək, yaşaya bilən viruslar törədib. yabanı tipli virusla müqayisədə orta dərəcədə azalmış titrə malikdir (Şəkil 3E).
NiRAN-vasitəçiliyi ilə NMP transferaz fəaliyyətinin aktiv RdRp domenindən asılı olub-olmadığını öyrənmək üçün RdRp motivi C-də iki valentli metal ionlarının (11) koordinasiyasında iştirak edən iki konservləşdirilmiş Asp qalığı Ala ilə əvəz edilmişdir.Nəticədə əldə edilən zülal nsp12_DD4823/4AA saxlayır. onun nsp9 NMPylation fəaliyyəti, nsp12 vasitəçiliyi ilə in vitro nsp9 NMPylation fəaliyyətinin polimeraza aktivliyini tələb etmədiyini göstərir (SI Əlavəsi, Şəkil S4).
Nsp12 üçün nsp9 spesifik NMP transferaz fəaliyyətini qurduqdan sonra NMP-nsp9 əlavəsini kütlə spektrometriyası (MS) ilə xarakterizə etməyə çalışdıq.Rekombinant HCoV-229E nsp9-un tam zülal kütlə spektri 12,045 Da-da pik göstərdi (Şəkil 4A).Nsp12-nin əlavə edilməsi nsp9-un keyfiyyətini dəyişmədi, bu, nsp12 və nsp9-un istifadə edilən şərtlərdə (denaturasiya) sabit kompleks əmələ gətirməyəcəyini göstərir (Şəkil 4A).UTP və GTP varlığında, nsp9 və nsp12 ehtiva edən reaksiyanın kütləvi ölçülməsi göstərdi ki, UTP-nin zülal kütləsi 306 Da, GTP-nin zülal kütləsi isə 345 Da hərəkət edib və bu, hər bir nsp9 molekulunun UMP və ya GMP-ni bağladığını göstərir. (Şəkil 4) C və D).NiRAN vasitəsi ilə nsp9 NMPylation üçün tələb olunan enerjinin NTP hidrolizindən və pirofosfatın sərbəst buraxılmasından qaynaqlandığı güman edilir.Bu reaksiyada nsp12-dən (fermentdən) 10 qat artıq nsp9 (hədəf) istifadə edilsə də, nsp9-un demək olar ki, tam NMPilasiyası müşahidə edilmişdir ki, bu da nsp12 və nsp9 arasındakı qarşılıqlı əlaqənin qısa müddətli olduğunu və nsp12-nin daha çox nsp9-u NMP ilə edə biləcəyini göstərir. in vitro molekul.
nsp12 və UTP və ya GTP varlığında nsp9-un tək NMPilasiyası.HCoV-229E nsp9-un (SI əlavəsi, Cədvəl S1) (AD) dekonvolyutsiya edilmiş tam zülal kütlə spektri göstərilmişdir.(A) nsp9 tək, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP varlığında, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP varlığında.
Nsp12 ilə UMPyla edilmiş nsp9 qalıqlarını müəyyən etmək üçün nsp9-UMP tripsinlə parçalandı.Nəticədə peptidlər nano-yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası (HPLC) ilə ayrılmış və onlayn tandem kütlə spektrometriyası (MS/MS) ilə təhlil edilmişdir.Byonic proqram paketindən (Protein Metrics) istifadə edərək məlumatların təhlili N-terminal amin turşusunun UMPilasiyasını göstərdi.Bu əl ilə təsdiqlənir.[UMP]NNEIMPGK prekursor peptidinin tandem kütlə spektri (SI əlavəsi, Şəkil S5A) UMP-nin nsp9-un 1-ci qalığı ilə bağlandığını göstərən 421 m/z-də bir fraqment aşkar etdi.
Nsp9-un N-terminusunda Asn Orthocoronavirinae üzvləri arasında qorunub saxlanılır (SI əlavəsi, Şəkil S6).N-terminalın əsas amin azotunun UMP üçün ən çox ehtimal olunan qəbuledici olduğuna inansaq da, N-terminalda NMP bağlanmasına dair əlavə sübut əldə etmək qərarına gəldik.Bu səbəbdən, HPLC ilə təmizlənmiş NMP və NMP ilə təmizlənmiş N-terminal peptid nsp9 aseton və natrium siyanoborohidridin iştirakı ilə əldə edilmişdir.Bu şərtlər altında yalnız sərbəst birincil aminlər propillə dəyişdirilə bilər (25).NNEIMPGK ardıcıllığı olan N-terminal nsp9-dan əldə edilən peptid iki əsas amin ehtiva edir, biri Asn-ın N-terminusunda, digəri isə C-terminusunda Lys-in yan zəncirindədir.Buna görə də, propil qrupları hər iki ucda təqdim edilə bilər.NMPilləşdirilməmiş peptidlərin ekstraksiya edilmiş ion xromatoqramları SI əlavəsində, Şəkil S5B-də göstərilmişdir.Gözlənildiyi kimi, N-terminal və C-terminal (mono)propilləşdirilmiş (SI əlavəsi, Şəkil S5B, yuxarı zolaq) və dipropilləşdirilmiş peptidlər (SI əlavəsi, Şəkil S5B, aşağı zolaq) müəyyən edilə bilər.Bu nümunə nsp9-un NMPylated N-terminal peptidinin istifadəsi ilə dəyişir.Bu halda, yalnız C-terminal propillənmiş peptidlər müəyyən edilə bilər, lakin N-terminal propillənmiş peptidlər və dipropillənmiş peptidlər müəyyən edilmir (SI Əlavəsi, Şəkil S5C), UMP-nin N-terminal əsas aminə köçürüldüyünü göstərir. qrupa dəyişiklik etməkdən çəkinin.
Sonra, hədəfə xüsusi məhdudiyyətləri müəyyən etmək üçün nsp9-un N-terminusunda qorunan qalıqları əvəz edirik (Ala və ya Ser ilə) və ya silirik.NiRAN-ın nsp9-un N-terminal qalığının əsas amini ilə nsp9-NMP əlavəsi əmələ gətirdiyini göstərən MS məlumatlarımıza əsaslanaraq, biz fərz etdik ki, nsp9 NMPilasiyası viral master proteazdan (Mpro, nsp5) nsp9 N-terminalını buraxmaq üçün tələb edir. onun poliprotein xəbərçisidir.Bu fərziyyəni yoxlamaq üçün biz E. coli-də nsp9 ehtiva edən nsp7-11 prekursor zülalını istehsal etdik və [α-32P] UTP (materiallar və üsullar) varlığında standart NMPylation testini həyata keçirdik.Şəkil 5A-da (zolaq 3) göstərildiyi kimi, kəsilməmiş nsp7-11 prekursoru nsp12 ilə radioaktiv işarələnməmişdir.Əksinə, əgər nsp7-11 rekombinant nsp5 tərəfindən nsp9-u (və digər nsps-ləri) prekursordan çıxarmaq üçün parçalanırsa, nsp9 ilə miqrasiya edən radio-etiketli zülal aşkar edilir ki, bu da NiRAN və N- kovalent nsp9-NMP əlavələrinin seçici formalaşması ilə bağlı qənaətimizi təsdiqləyir. .N-terminal Asn-in terminal birincil amin (pp1a/pp1ab-da 3825-ci mövqe).Bu nəticə N-terminusunda bir və ya iki əlavə qalıq olan nsp9 konstruksiyasından istifadə edilən təcrübələrlə də təsdiqlənir.Hər iki halda, nsp9-un NiRAN vasitəçiliyi ilə UMPylation ləğv edildi (SI Əlavəsi, Şəkil S7).Sonra, nsp9-un N-terminalında 3825-NNEIMPK-3832 peptid ardıcıllığından silinmiş bir və ya iki Asn qalığı olan bir zülal istehsal etdik.Hər iki halda, nsp9 UMPylation tamamilə bloklandı (Şəkil 5B), real nsp9 N-terminusunun NMP reseptoru kimi çıxış etdiyinə dair əlavə sübut təmin etdi.
Nsp9-un proteolitik emalı və N-terminal qalıqlarının nsp12 vasitəçiliyi ilə UMPilasiyada rolu.(A) nsp9 UMPylation pulsuz nsp9 N-terminal tələb edir.Nsp7-11-His6 rekombinant Mpro (nsp5-His6) varlığında və ya olmamasında UTP ehtiva edən NMPylation aşkarlama tamponunda 30 °C-də əvvəlcədən inkubasiya edilir.3 saatdan sonra Materiallar və Metodlar bölməsində təsvir olunduğu kimi nsp12-His6 əlavə edərək NMPylation analizinə başlayın.Nsp5-His6 (zolaq 1) və nsp9-His6 (zolaq 2) olan reaksiya nəzarət kimi istifadə edilmişdir.10 dəqiqədən sonra reaksiya dayandırıldı və reaksiya qarışığı SDS-PAGE ilə ayrıldı.Zülal Coomassie Brilliant Blue (A, yuxarı) ilə boyandı.Nsp7-11-His6 prekursoru və nsp5-His6 vasitəçiliyi nəticəsində yaranan emal olunmuş məhsul sağda göstərilir.Nəzərə alın ki (kiçik ölçülərinə görə) nsp7 və nsp11-His6 bu geldə aşkar edilmir və reaksiya nsp5-His6 ilə tamamlanır (1 və 4-cü zolaqlar; nsp5-His6-nın mövqeyi bərk dairə ilə göstərilir) və ya nsp9-His6 (Lane 2) qalıq çirkləri kimi az miqdarda MBP (açıq dairələrlə qeyd olunur) ehtiva edir, çünki onlar MBP birləşmə zülalları kimi ifadə olunur (SI əlavəsi, Cədvəl S1).(B) Nsp9-His6 variantında bir və ya iki N-terminal Asn qalığı yoxdur (qalıqların pp1a/pp1ab-dakı mövqeyə görə nömrələnməsi) və təmizlənir və nsp12-His6 və [α-32P] UTP ilə inkubasiya edilir.B, Coomassie ilə boyanmış SDS-PAGE yuxarıda, B, müvafiq avtoradioqraf aşağıda göstərilir.Molekulyar çəki markerinin mövqeyi (kilodaltonlarla) solda göstərilir.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminalında qorunan qalıqlar Ala və ya Ser ilə əvəz olundu və eyni miqdarda protein nsp12-His6 vasitəçiliyi ilə UMPylation reaksiyasında istifadə edildi.Reaksiya məhsulları SDS-PAGE ilə ayrıldı və Coomassie Brilliant Blue (C, yuxarı) ilə boyandı və radioaktiv etiketli nsp9-His6 fosforessensiya təsviri ilə aşkar edildi (C, orta).İstinad kimi vəhşi tip (ağırlıq) zülaldan istifadə edərək (100%-ə təyin olundu), nisbi NMPylation aktivliyi (orta ± SEM) üç müstəqil təcrübədən hesablandı.(D) HCoV-229E vəhşi tipli Huh-7 hüceyrələri ilə yoluxmuş Huh-7 hüceyrələrinin p1 hüceyrə mədəniyyətinin supernatantında virus titrləri və nsp9-da təyin olunmuş amin turşusu əvəzetmələrini daşıyan mutantlar lövhə analizi ilə müəyyən edilmişdir.Replikasiya çatışmazlığı olan RdRp motivi C ikiqat mutant DD4823/4AA mənfi nəzarət kimi istifadə edilmişdir.
Nsp9-un N-terminusu (xüsusilə 1, 2, 3 və 6-cı mövqelər) Orthocoronavirinae alt ailəsinin üzvləri arasında çox qorunur (SI əlavəsi, Şəkil S6).Bu qalıqların nsp12-vasitəçili nsp9 NMPilasiyasında mümkün rolunu öyrənmək üçün nsp9-un N-terminusunda iki ardıcıl Asn qalığı Ala və ya Ser (tək və ya kombinasiyada) ilə əvəz edilmişdir.Vəhşi tipli nsp9 ilə müqayisədə, N3825-in Ala və ya Ser ilə əvəz edilməsi nsp12-vasitəçiliyi ilə UMPilasiyanın iki dəfədən çox azalması ilə nəticələndi (Şəkil 5C).NMPilasiyanın N-terminal qalığının yan zəncirinin əvəzinə N-terminal əsas aminində baş verdiyi qənaətimizə uyğun olaraq, N3825A və N3825S-in dəyişdirilməsi ilə əhəmiyyətli qalıq NMPylation müşahidə etdik.Maraqlıdır ki, əgər ikinci Asn Ala və ya Ser ilə əvəz edilərsə, nsp9 UMPylation daha güclü şəkildə azalır (10 dəfədən çox), Ala-nın 3, 4 və 6-cı mövqelərdə dəyişdirilməsi isə nsp9 UMPylation üzərində yalnız orta dərəcədə təsir göstərir (Şəkil 2). ) .5C).Oxşar nəticələr ATP, CTP və ya GTP istifadə edərək əldə edilmişdir (SI əlavəsi, Şəkil S8).Kollektiv olaraq, bu məlumatlar nsp9 NMPylation-da N2826-nın (nsp9-da 2-ci mövqe) əsas rolunu göstərir.
Nsp9-un N-terminusu ilə NMPylation arasında funksional korrelyasiyaya dair əlavə sübut əldə etmək üçün biz Koronavirus ailəsinin nsp9 ardıcıllığının (104 ilə 113 qalıq arasında dəyişir) çox ardıcıl düzülüşü (MSA) həyata keçirdik (SI Əlavəsi, Şəkil S6).Ümumilikdə, Orthocoronavirinae alt ailəsinin müxtəlif məməliləri, quşları və sürünən sahiblərini yoluxduran 5 cinsinin 47 (məlum və ehtimal olunan) növündə cəmi 8 qalığın dəyişməz olduğu aşkar edilmişdir.Ən geniş dəyişikliklər, o cümlədən silmələr və əlavələr, əvvəlki struktur tədqiqatları (26 ??28) tərəfindən müəyyən edildiyi kimi, nsp9-un ikinci dərəcəli struktur elementləri arasındakı dövrlərdə müşahidə edilmişdir.Nsp9-un C-terminal hissəsinin β zəncirində və α spiralında beş dəyişməz qalıq tapıldı.Üç dəyişməz qalıq nsp9-un N ucunun NNE motivini təşkil edir.Məlum olub ki, bu motivin ikinci Asn-ı uzaqdan qohum olan qurbağa koronavirusunun hipotetik nsp9 tərəfindən də paylaşılan yeganə dəyişməz qalıqdır və Alphaletovirusun Letovirinae alt ailəsində Microhyla letovirus 1 növünü təmsil edir.nsp9 ikincil struktur elementlərində qalıqların qorunması, qatlama və ya məlum RNT bağlama xüsusiyyətlərini saxlamaq üçün struktur mülahizələrlə rasionallaşdırıla bilər.Bununla belə, bu əsaslandırma NNE-nin qorunmasına aid edilmir və bu araşdırmadan əvvəl tripeptid ardıcıllığının dəyişməsini məhdudlaşdıran məhdudiyyətlərin təbiəti tamamilə gizlədilib.
Koronavirusun təkrarlanmasında nsp9-NMPylation və NNE konservasiyasının əhəmiyyətini müəyyən etmək üçün biz nsp9 N-terminal qalıqlarının tək və ya ikiqat əvəzlənməsini daşıyan HCoV-229E mutantlarını istehsal etdik ki, bu da nsp9 NMPylation in vitro zərərli olduğunu göstərir.Başlamazdan əvvəl biz bu əvəzetmələrin (nsp8|9 parçalanma sahəsinin yaxınlığında) C-terminal pp1a bölgəsinin proteolitik emalına təsir edib-etmədiyi sualına cavab verməyə çalışırıq.Nsp9-un N-terminusunda müvafiq əvəzediciləri ehtiva edən nsp7-11 poliprotein konstruksiyaları dəsti E. coli-də istehsal edilmiş və rekombinant Mpro ilə kəsilmişdir.Dörd sahənin proteolitik parçalanması (nsp9 cinah yeri daxil olmaqla) Mpro-vasitəçiliyi ilə nsp8|9 parçalanmasına mane olan bu zülallarda struktur dəyişiklikləri istisna olmaqla, hər hansı daxil edilmiş əvəzetmələrdən (SI əlavəsi, Şəkil S9) əhəmiyyətli dərəcədə təsirlənmir (və ya digər) vebsayt.
Huh-7 hüceyrələri genom uzunluğunda HCoV-229E RNT ilə transfeksiya edildi, nsp9 N terminalında konservləşdirilmiş NNE tripeptidlərində (N3825, N3826 və E3827) Ala və ya Ser əvəzetmələrini kodlaşdıraraq, mutasiyaların əksəriyyətinin ölümcül olduğunu göstərdi.Biz N-terminal Asn-ın Ser və ya Ala-nı (N2835A və ya N2835S) əvəz etməklə virusu xilas edə bildik, lakin virusu NNE ardıcıllığında (N3826A, N3826S, NN3825/6AA,) digər tək və ikiqat mutasiyalarla bərpa edə bilmədik. NN3825/6SS) , E3827A) (Şəkil 5D).
Bu nəticələr göstərir ki, koronavirusların toxuma mədəniyyətində replikasiyası məhduddur (eyni və ya oxşar), orqanizmdə nsp9 NMPylation sahələrinin təbii mutasiyasını məhdudlaşdırır və bu cavabın koronavirusların həyat tsiklində əsas rolunu dəstəkləyir.
Son sınaq dəstində SARS-CoV-2 nsp12 və nsp9 etiketli C-terminal His6 və E. coli-də nsp12-nin iki mutant forması istehsal etdik.NiRAN və RdRp domenlərindəki aktiv sayt qalıqları müvafiq olaraq əvəzinə Ala istifadə edilmişdir (Şəkil 6A və SI əlavəsi, Cədvəl S2).SARS-CoV-2 nsp12-də K4465, NiRAN fəaliyyəti və HCoV-229E replikasiyası üçün tələb olunduğu sübut edilən HCoV-229E-dəki K4135-ə uyğundur (SI Əlavəsi, Şəkil S2) (Şəkil 3D və E).Bu qalıq, həmçinin, əvvəllər NiRAN-ın özünü UMPilasiyası/öz-özünə GMPilasiyası üçün zəruri olduğu göstərilən arterial virus EAV nsp9 K94 qalığına uyğun gəlir (16).Şəkil 6B-də göstərildiyi kimi, SARS-CoV-2 nsp12 substrat kimi nsp9-dan istifadə edərək UMP transferaz aktivliyinə malikdir, nsp12_K4465A aktiv sayt mutantı isə qeyri-aktivdir.RdRp motivi C-nin SDD xarakterik ardıcıllığında ikiqat əvəzetmə UMP transferaz aktivliyinə təsir göstərmir (Şəkil 6B, bu da RdRp aktivliyinin nsp9 UMPylation-a birbaşa təsir göstərmədiyini göstərir.Oxşar məlumatlar CTP, GTP və ATP istifadə edərək əldə edilmişdir (SI əlavəsi, Şəkil S10).Xülasə, bu məlumatlar göstərir ki, NiRAN vasitəçiliyi ilə nsp9 NMPylation ortokoronavirus alt ailəsinin müxtəlif cinslərini təmsil edən koronaviruslarda konservativ aktivliyə malikdir.
SARS-CoV-2 nsp9-un nsp12 vasitəçiliyi ilə NMPilasiyası.(A) NMPylation testində istifadə olunan rekombinant zülalı göstərən Coomassie ilə boyanmış SDS-poliakrilamid gel.Nəzarət kimi, SARS-CoV-2 nsp12-nin NiRAN domenində (K4465A) və RdRp domenində (DD5152/3AA) aktiv yer əvəzedicisi olan mutant zülaldan istifadə edilmişdir.Qalığın nömrələnməsi pp1ab-dakı mövqeyə əsaslanır.(B) nsp12-His6-nın substratı kimi nsp9-His6 və [α-32P]UTP istifadə edərək UMPylation aşkarlanmasının avtoradioqrafı (vəhşi tip [wt] və mutant).Etiketli zülalın molekulyar kütləsi (kilodaltonla) solda göstərilir.
NiRAN domenləri ümumiyyətlə Nidoviralesdə (16) qorunur, bu da onların Nidovirusun təkrarlanması üçün vacib olan enzimatik reaksiyaları kataliz etdiyini göstərir.Bu araşdırmada biz sübut edə bildik ki, koronavirusun NiRAN domeni NMP-ni (NTP-dən yaradılan) virusun təkrarlanmasında iştirak edən sirli RNT bağlayıcı zülal olan nsp9-a köçürür (26 ?? 29), onu təbii hədəf kimi təyin edir və coronavirus RTC-nin tərəfdaşı.
NiRAN domeni monofiletik, lakin yüksək differensiallaşdırılmış Nidovirales sırasında bütün ailələrdə qorunan çox az sayda qalıq ehtiva edən üç ardıcıl motivi (AN, BN və CN) bölüşür (8, 16).Son tədqiqatlar göstərdi ki, onlar struktur olaraq ilkin olaraq SelO ailəsi adlanan zülal kinazlara bənzər zülalların əsasən xarakterik olmayan ailəsi ilə əlaqəlidirlər (17, 19, 22, 30, 31).SelO ilə əlaqəli zülallarda kinaz qıvrımları var, lakin klassik kinazalarda bir neçə qorunmuş aktiv sahə qalıqları yoxdur (22, 32).Aktiv sahəyə bağlanan və xüsusi qarşılıqlı təsirlərlə sabitləşən ATP molekullarının tərs oriyentasiyasına əsaslanaraq, SelO zülal substratına (22) AMP-ni (fosfat əvəzinə) köçürməsi fərziyyə edildi və sonradan təsdiq edildi, digər bakterial SelO kimi protein YdiU isə Bu yaxınlarda müxtəlif zülal substratlarının Tyr və Onun qalıqlarına UMP-nin kovalent bağlanmasını katalizlədiyi göstərilmişdir (33).
Koronavirus NiRAN domeninin ehtimal olunan aktiv sayt qalıqlarının proqnozunu təsdiqləmək və genişləndirmək üçün biz koronavirus nsp12 üzərində mutasiya analizini aparmaq üçün biokimyəvi və əks genetik üsullardan istifadə etdik (Şəkil 3D və E və SI əlavəsi, Şəkil S3 və cədvəl) S1â S4).Məlumatlar göstərir ki, HCoV-229E K4135, R4178 və D4280-in Ala ilə dəyişdirilməsi hüceyrə kulturasında in vitro NMP transferaz aktivliyini və virus replikasiyasını aradan qaldırır (Şəkil 3D və E və SI əlavələri, Şəkil S3), onların NTP γ-fosfatda mövcudluğunu dəstəkləyir. ( K4135, R4178) və aktiv sahə metal ionlarının koordinasiyası (D4280).K4135 (17) mövqeyini sabitləşdirmək üçün proqnozlaşdırılan quş yuvası virusu diapazonunda konservləşdirilmiş Glu-nun E4145A dəyişdirilməsinin viral replikasiyanı aradan qaldırdığı göstərildi, lakin təəccüblüdür ki, aktivlik in vitro NMPylation analizində saxlanıldı (Şəkil 3D və E və SI əlavəsi, Şəkil S3 və Cədvəllər S1–S4).Salmonella typhimurium (E130A) (33) YdiU homoloqunda müvafiq əvəzetmə tətbiq edildikdə oxşar müşahidə edildi.Birlikdə götürdükdə, bu məlumatlar katalitik funksiyadan çox bu qorunan qalığın tənzimləyici funksiyasını dəstəkləyir.
Konservləşdirilmiş Phe qalığını (F4281A) HCoV-229E NiRAN domenində (8) nestovirus diapazonunda əvəz etmək in vitro NMPilləşmə aktivliyinin azalması və hüceyrə mədəniyyətində virusun təkrarlanmasının əhəmiyyətli dərəcədə azalması ilə nəticələndi (Şəkil 3D, E və SI) əlavə, Şəkil S3).Məlumatlar bu qalığın mühüm tənzimləyici funksiyası ilə uyğundur, məsələn, əvvəllər göstərilən homoloji DFG motivi Phe qalığı.Klassik zülal kinazlarında Mg2+ bağlayıcı ilmənin bir hissəsidir və onurğanın yığılmasına və tənzimlənməsinə kömək edir???Effektiv katalitik fəaliyyət üçün tələb olunur (32, 34).Ala və Arg-ın K4116 qalıqları üçün (preAN motivində) əvəz edilməsi müvafiq olaraq viral replikasiyanı aradan qaldırdı və gözlənildiyi kimi təqdim edilən amin turşusu yan zəncirindən asılı olaraq in vitro NMP transferaz aktivliyinə fərqli təsir göstərdi (Şəkil 3D və E və SI əlavələri , Şəkil S3).Funksional məlumatlar struktur məlumatlara uyğundur və bu qalığın ATP fosfatla qarşılıqlı əlaqə qurduğunu göstərir (17).Digər yuvalanmış virus ailələrinin NiRAN domenində HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116-nın mövqeyi Lys, Arg və ya His (8) tərəfindən tutulur ki, bu da bu xüsusi qalığın funksional məhdudiyyətinin yumşaldıldığını göstərir.D4188A və D4283A-nın dəyişdirilməsi ferment aktivliyini aradan qaldırır və ya güclü şəkildə azaldır və virus replikasiyasını aradan qaldırır (Şəkil 3).Bu iki qalıq yuvalanmış virusların əksəriyyətində (lakin hamısında deyil) qorunub saxlanılır (8) bu, mühüm ailəyə xas, lakin ola bilsin ki, katalitik olmayan funksiyanı göstərir.Coronaviridae və ya digər Nestioviridae ailələrində (8) qorunmayan bir neçə digər Lys və Asp qalıqlarının (K4113A, D4180A, D4197A və D4273A) ala əvəzediciləri nəzarət kimi istifadə edilmişdir.Gözlənildiyi kimi, bu əvəzetmələr əsasən tolerantdır, ferment aktivliyində cüzi azalma və bəzi hallarda virusun təkrarlanması (Şəkil 3 və SI əlavəsi, Şəkil S3).Ümumilikdə, koronavirus mutagenezi məlumatları EAV nsp9 (koronavirus nsp12 ortoloqu) qalığı K94 (HCoV- 229E K4135-ə uyğundur) mühüm funksiyaları yerinə yetirdiyi EAV NiRAN-RdRp (16)-nın özünü GMP və tərs genetik məlumatları ilə çox uyğundur. R124 (R4178-ə uyğundur), D132 (D4188-ə uyğundur), D165 (D4280-ə uyğundur), F166 (F4281-ə uyğundur).Bundan əlavə, HCoV-229E mutagenez məlumatları əvvəllər bildirilmiş SARS-CoV əks genetik məlumatlara (16) uyğundur və genişlənir, eynilə müvafiq CN motivi Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 üçün müşahidə edilənlərə çox oxşardır. təsvir olunan fenotip -F219A və HCoV-229E_F4281A (Şəkil 3 D və E və SI əlavəsi, Şəkil S3 və Cədvəl S1-S4).
UTP və GTP-yə (öz-özünə NMPylation reaksiyasında) açıq üstünlük verən EAV ortoloqları (16) ilə müqayisədə araşdırmamız göstərir ki, koronavirus NiRAN domeni (HCoV-229E və SARS-CoV-2 ilə təmsil olunur) effektiv ola bilər. köçürüldü UMP-yə bir qədər üstünlük verilsə də, dörd NMP-nin hamısı (Şəkil 1 və 3).Xüsusi NTP ko-substratının nisbətən aşağı spesifikliyi bu yaxınlarda bildirilmiş SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkompozit quruluşuna uyğundur, burada ADP-Mg2+ NiRAN-ın aktiv sahəsinə bağlanır, lakin adenin hissəsi ilə deyil. xüsusi qarşılıqlı əlaqənin formalaşması (17).Tədqiqatımızda NMPilləşmə reaksiyasında istifadə edilən nukleotidin növü mutant zülalın aktivliyinə diferensial təsir göstərmir (SI Əlavəsi, Şəkil S3), bu qalıqların heç birinin spesifik nukleobazanın bağlanması ilə sıx əlaqədə olmadığını göstərir.Koronavirusların və arterial virusların NiRAN domenlərində müşahidə edilən müxtəlif NTP ko-substrat üstünlüklərinin struktur əsasları və potensial bioloji əhəmiyyəti hələ də öyrənilməlidir;onlar doğru ola bilər və ya onların müvafiq tədqiqatlarının məhdudiyyətlərinə görə ola bilər.Hal-hazırda, istisna etmək olmaz ki, arterial virus NiRAN domeninin potensial NMPylator aktivliyi (əvvəllər xarakterizə olunan özünü NMPilasiya fəaliyyəti ilə müqayisədə) arterial və koronavirus arasındakı oxşarlıq nəzərə alınmaqla, fərqli bir ko-substrat üstünlük təşkil edir. NiRAN domeni limitdədir.Ardıcıllıqla Müqayisə et (16).Mg2+-dan kofaktor kimi istifadə edən psevdokinaz SelO ilə müqayisədə, koronavirus və arterial virus NiRAN-ın fəaliyyəti Mn2+-dan asılıdır (16) (Şəkil 3C və SI əlavəsi, Şəkil S1).Mn2+ asılılığı və UTP-yə aşkar üstünlük verilməsi NMPilator zülalının qeyri-adi xüsusiyyətidir və bu yaxınlarda Salmonella typhimurium-un YdiU zülalında təsdiq edilmişdir ki, bu da hüceyrələri stress induksiyasından qorumaq üçün ciddi Mn2+-dan asılı protein şaperon UMPilasiyasını kataliz edir Hüceyrə ATP hovuzu ( 33).
Koronavirusun NiRAN domeni və hüceyrə zülal kinazları (17, 19) arasında bu yaxınlarda təsvir edilmiş struktur oxşarlığı NiRAN-ın bu işdə bildirdiyimiz digər zülallarla NMP-ni kovalent şəkildə əlaqələndirmək qabiliyyətinə əlavə dəstək verir.Mümkün NiRAN hədəfləri üçün axtarışımızı birbaşa və ya dolayı yolla RTC-nin ORF1b ilə kodlanmış replikasına kömək etdiyi bilinən HCoV-229E ORF1a tərəfindən kodlanmış zülallara yönəltdik (12, 35).Təcrübələrimiz nsp9-un effektiv və spesifik NMPilasiyası üçün qəti sübutlar təqdim edir (Şəkil 2).Hədəf zülal fermentdən (nsp12) 8-10 dəfə yüksək olan molar artıqlığında istifadə olunarsa, nsp9-un tamamilə (mono)NMPləşdiyi təsdiqlənir (Şəkil 4).Nsp12 və nsp9 arasındakı qarşılıqlı əlaqənin qısamüddətli olduğu və nsp9 ilə sabit bir kompleks yaratmayacağı qənaətinə gəldik (digər RTC alt bölmələri olmadıqda).Bu nəticə SARS-CoV proteomunda zülal qarşılıqlı əlaqəsi tədqiqatları ilə dəstəklənir (35).MS analizi nsp9-un N-terminal qalığının əsas aminini NMPyasiya yeri olaraq təyin etdi (SI əlavəsi, Şəkil S5).Fosforamidat bağının və N-terminal amin qrupunun əmələ gəlməsi NiRAN-vasitəçili NMPilləşmə fəaliyyətini Pseudomonas syringae SelO-vasitəçili AMPilləşmə reaksiyasından fərqləndirir, bu da Ser, Thr və ya Tyr qalıqlarında Peptid əlavəsində O ilə əlaqəli AMP-nin əmələ gəlməsini katalizləşdirir. 22) və S. typhimurium YdiU O ilə əlaqəli (Tyr ilə) və N ilə əlaqəli (Onun ilə) peptid-UMP əlavələri əmələ gətirir.SelO zülal ailəsi haqqında mövcud olan məhdud məlumat bu böyük zülal ailəsinin üzvlərinin peptid-NMP əlavələrinin əmələ gəlməsində çox fərqləndiyini göstərir.Bu, daha çox öyrənilməyə layiq olan maraqlı bir müşahidədir.
Bu araşdırmada əldə edilən məlumatlar bizi nsp9-un NMPylation üçün pulsuz N-terminus tələb etdiyi fərziyyəsinə səbəb oldu.Viral replikasiya kontekstində bu, Mpro və pp1ab-ın vasitəçiliyi ilə poliprotein pp1a replikasında nsp8|nsp9 emal sahəsinin proteolitik parçalanması ilə təmin ediləcək.Əksər koronaviruslarda, bu xüsusi sayt (HCoV-229E-də VKLQ|NNEI) ilə bütün digər koronavirus Mpro parçalanma yerləri arasındakı fərq Asn-dır (Ala, Ser və ya Gly kimi başqa bir kiçik qalıq əvəzinə) P1â tutur???Yer (36).İlkin tədqiqatlarda əldə edilən peptid parçalanma məlumatları göstərdi ki, nsp8|nsp9 sahəsinin parçalanma effektivliyi digər saytlardan daha aşağı olub, bu onu göstərir ki, 1) bu xüsusi sahə C-terminalının vaxtında əlaqələndirilmiş işlənməsində tənzimləyici rola malik ola bilər. pp1a bölgəsi və ya 2) a Virusun təkrarlanmasında xüsusi qorunan nsp9 N-terminalının rolu (37).Məlumatlarımız (Şəkil 5A) real N-terminal ardıcıllığını daşıyan nsp9-un rekombinant formasının nsp12 tərəfindən effektiv şəkildə NMPlaşdırıldığını göstərdi.N-terminal cinah ardıcıllığı Xa faktoru (nsp9-His6; SI əlavəsi, Cədvəl S1) və ya Mpro-vasitəçili parçalanma (nsp7-11-His6; Şəkil 5A və SI əlavəsi, Cədvəl S1) ilə çıxarıldı.Əhəmiyyətli odur ki, kəsilməmiş nsp9 tərkibli prekursor nsp7-11-His6, nsp12-nin NMPilasiyasına müqavimət göstərdi, bu da məlumatlarımıza uyğundur və nsp9-NMP əlavəsinin N-terminal əsas amin vasitəsilə əmələ gəldiyini göstərir (SI əlavəsi, Şəkil S5) .NiRAN substratının spesifikliyini daha dərindən başa düşmək üçün biz nsp9-un bitişik N-terminal qalıqlarına diqqət yetirdik.Digər zülallar olmadıqda, onlar strukturca çevikdirlər və onların nsp9-un etiketlənməmiş formasında aşkarlanmasının qarşısını alırlar (26 28, 38), onların məhdud təbii variasiyasını göstərir. nsp9 N-terminal fraqmentinin funksiyası.Bu bölgədə qorunan qalıqların ala əvəzetmələri (Şəkil 5C və D və SI əlavəsi, Şəkil S8) N3826-nın in vitro nsp9 NMPilasiyası üçün vacib olduğunu, N3825A və E3827A əvəzetmələrinin isə NMPilasiyanın azalmasına səbəb olduğunu, M3829A və P383 əvəzedicilərinin isə bunu etmədiyini göstərir. .Aydındır ki, nsp9 NMPylation təsir göstərir.N-terminal Asn (N3825A, N3825S) əvəzlənməsi hüceyrə kulturasında nsp9 NMPylation və virus replikasiyasına (Şəkil 5C və D) yalnız orta dərəcədə təsir göstərsə də, N-terminal 3825-NN dipeptidindən Asn qalıq ardıcıllığının silinməsi. olduğu sübut edilmişdir Bu viruslar üçün öldürücüdür, bu onu göstərir ki, N-terminusda digər qalıqdan əvvəl bir Asn qalığı tələb olunur, tercihen Asn, baxmayaraq ki, oxşar qalıqların dəyişdirilməsinə qismən dözmək olar (Şəkil 5B, C və D).Belə nəticəyə gəldik ki, 3825-NN dipeptidi, xüsusən də koronavirus diapazonu daxilində qorunan və əsas N3826 qalığı (SI əlavəsi, Şəkil S6), NiRAN-ın aktiv yerində nsp9 N-terminusunun düzgün bağlanmasını və oriyentasiyasını təmin edir.
Bütün alt ailələrin konservləşdirilmiş Glu üçün Ala (E3827A) əvəz edilməsi in vitro nsp9 NMPylation saxlayır, lakin hüceyrə mədəniyyətində viruslar üçün öldürücüdür (Şəkil 5C və D), bu qalığın əlavə funksiyasını göstərir, məsələn, əsas qarşılıqlı təsirlərdə (NMPyated və ya dəyişdirilməmiş) ) nsp9 N-terminusu və virusun təkrarlanmasında iştirak edən digər amillər.Nsp9 mutasiyaları nsp9 və ya hər hansı bitişik nsps (39) (SI Əlavəsi, Şəkil S9) proteolitik prosesinə təsir göstərmədi, bu da müşahidə edilən bir neçə nsp9 mutasiyasının ölümcül fenotiplərinin C proteolitik prosesi-terminal pp1a sahəsinin tənzimlənməsinin pozulmasından qaynaqlanmadığını göstərir. .
Yuxarıdakı məlumatlar pp1a/pp1ab-da nsp8|9 parçalanma sahəsinin Mpro vasitəçiliyi ilə müalicəsindən sonra nsp9-un N-terminalının UMPyated (və ya digər NMP ilə qismən dəyişdirilə bilər) sübutunu təqdim edir.Bundan əlavə, nsp9-un N-terminalının (koronavirus ailəsindəki tək və dəyişməz Asn qalıqları da daxil olmaqla) əla saxlanması və bu araşdırmada əldə edilən əks genetik məlumatlar (Şəkil 3E və 5D) bizi təsvir edilən nsp9 NMPylation-in olduğu qənaətinə gətirdi. bioloji əlaqəlidir və koronavirusun təkrarlanması üçün vacibdir.Bu modifikasiyanın funksional nəticələri, məsələn, əvvəllər təsvir edilmiş (qeyri-spesifik) nsp9 (dəyişdirilməmiş forma) RNT-nin bağlanma fəaliyyəti (2628) ilə bağlı öyrənilməlidir.N-terminal NMPylation həmçinin nsp9-un zülal və ya RNT substratları ilə qarşılıqlı əlaqəsinə və ya müxtəlif dörd səviyyəli birləşmələrin formalaşmasına təsir göstərə bilər.Bunlar struktur tədqiqatlarda müşahidə edilmiş və xüsusilə bu modifikasiya halında (26- ââ29, 40) olmadığı halda, koronavirusun təkrarlanması ilə funksional olaraq əlaqəli olduğu təsdiq edilmişdir.
Koronavirus NiRAN domeninin hədəf spesifikliyinin hələ də daha ətraflı təsvir edilməsinə ehtiyac olsa da, məlumatlarımız göstərir ki, koronavirus NiRAN domeninin protein hədəf spesifikliyi çox dardır.Bütün nidovirus ailələrinin NiRAN domenində əsas aktiv sahə qalıqlarının (8, 16) mühafizəsi bu zülalların konservləşdirilmiş NMPylatorunun fəaliyyətini güclü şəkildə dəstəkləsə də, bu domenin substratı bağlayan cib qalıqlarının kimliyi Konservasiya və konservasiya xarakterik olaraq qalır. , və Nidovirales məqsədləri üçün müxtəlif ailələr arasında fərqlənə bilər.Eynilə, digər yuvalanmış virusların müvafiq hədəfləri hələ müəyyən edilməmişdir.Onlar nsp9 və ya digər zülalların uzaq ortoloqları ola bilər, çünki ümumiyyətlə yuvalanmış viruslarda qorunan beş replika domenindən kənar ardıcıllıqlar daha az qorunur (8), Mpro və NiRAN arasındakı genom massivi, Onların arasında nsp9 korona virusu.
Bundan əlavə, biz hazırda NiRAN domeninin əlavə (o cümlədən mobil) hədəflərə malik olması ehtimalını istisna edə bilmərik.Bu halda, qeyd etmək lazımdır ki, bu yeni yaranan zülal NMPylators (NMPylators) (30, 31) tərkibindəki bakterial homoloqların “master tənzimləyiciləri” varmı?NMP müxtəlif hüceyrə zülallarını modulyasiya edir ki, onların aşağı axın fəaliyyətini tənzimləyir və ya aradan qaldırır və bununla da hüceyrə stress reaksiyası və redoks homeostazı kimi müxtəlif bioloji proseslərdə rol oynayır (22, 33).
Bu araşdırmada (Şəkil 2 və 4 və SI Əlavəsi, Şəkillər S3 və S5) sübut edə bildik ki, nsp12 UMP (NMP) hissəsini nsp9-da tək (konservləşdirilmiş) mövqeyə köçürür, digər zülallar isə dəyişdirilməmişdir. istifadə olunur Şərtlər altında, yaxşı müəyyən edilmiş (boş deyil) substratın spesifikliyi dəstəklənir.Buna uyğun olaraq, N-terminal nsp9 NMPylation ilə müqayisədə, nsp12-nin öz NMPylation fəaliyyəti çox aşağıdır, onun aşkarlanması daha uzun avtoradioqrafiyaya məruz qalma müddəti tələb edir və nsp12 konsentrasiyasında 10 dəfə artım istifadə olunur.Bundan əlavə, MS analizimiz nsp12-nin NMPylation üçün sübut təmin edə bilmədi, bu da NiRAN domeninin öz-özünə NMPyasiyasının (ən yaxşı halda) ikinci dərəcəli fəaliyyət olduğunu göstərir.Bununla belə, qeyd etmək lazımdır ki, digər tədqiqatlar bakterial NMPylatorun öz-özünə AMPilasiya statusunun onların digər zülal substratlarında NMPilləşmə fəaliyyətini idarə edə biləcəyinə dair ilkin sübutlar təqdim etmişdir (22, 33).Buna görə də, EAV nsp9 (16) və coronavirus nsp12 (bu araşdırma) üçün bildirilən özünü NMPyasiya fəaliyyətlərinin mümkün funksional təsirlərini, o cümlədən C-terminal RdRp domeninin bükülməsinə təklif olunan şaperona bənzər təsirləri araşdırmaq üçün daha çox araşdırmaya ehtiyac var. 16) ).
Əvvəllər, nidoviral NiRAN domeninin mümkün aşağı axın funksiyaları ilə bağlı bir neçə fərziyyə, o cümlədən RNT liqaza, RNT ilə örtülmüş guanilat transferaz və zülal hazırlama fəaliyyəti (16) nəzərdən keçirilmişdir, lakin onların heç biri mövcud aşağı axın funksiyaları ilə uyğun gəlmir.Aşağıdakı mövqelərdə əldə edilən məlumatlar əlavə fərziyyələr irəli sürmədən tam olaraq eyni vaxtdadır.Bu tədqiqatda əldə edilən məlumatlar NiRAN domeninin zülalla əlaqəli RNT sintezinin başlanmasında iştirak etdiyinə ən uyğundur (lakin sübut edə bilməz).Əvvəllər hesab olunurdu ki, NiRAN domeninin funksiyası 5??²-RNT qapağı və ya RNT bağlama reaksiyaları bunlardan təsirlənmir və digər məlumatların dəstəyi.Buna görə də, məsələn, NiRAN-ın aktiv sahəsi ümumi əsas kimi konservləşdirilmiş Asp-ni əhatə edir (Pseudomonas syringae SelO-da D252; HCoV-229E pp1ab-da D4271; SARS-CoV-2 nsp12-də D208) (SI Əlavəsi, şəkil 2) ).S2) (17, 22, 33), halbuki ATP-dən asılı RNT liqaza və RNT qapaq fermentində kataliz dəyişdirilməmiş Lys qalığını ehtiva edən kovalent ferment-(lizil-N)-NMP ara məhsulu tərəfindən həyata keçirilir. 41).Bundan əlavə, qorunan zülal hədəfləri üçün koronavirus NiRAN-ın diqqətəlayiq ardıcıllığa əsaslanan spesifikliyi və NTP ko-substratları üçün rahat spesifikliyi (UTP-yə üstünlük verir) NiRAN vasitəçiliyi ilə bağlanan ferment və ya RNT liqaza bənzər funksiyalara qarşı çıxır.
Aydındır ki, nsp9-UMP-nin (nsp9-NMP) zülalla induksiya olunan RNT sintezində mümkün rolunu yoxlamaq və sübut olunarsa, ətraflı izah etmək üçün çoxlu əlavə iş lazımdır ki, bu da bir neçə maraqlı, lakin (indiyə qədər) əvvəllər bildirilmiş hesabatları birləşdirəcək. .İzolyasiya edilmiş müşahidələr.Məsələn, müəyyən edilmişdir ki, koronavirusun mənfi zəncirli RNT-nin sonu oliqo(U) zəncirindən başlayır (42, 43).Bu müşahidə, mənfi zəncirli RNT-nin sintezinin nsp9-un UMPylated formasının poli(A) quyruğuna (tetikleyicilər) bağlanması ilə başlandığı fikri ilə uyğun gəlir, bu da onun RNT-yə bağlanması ilə təşviq edilə bilər. başqa bir RTC zülalı.Daha sonra nsp9 tərəfindən təmin edilən UMP hissəsi genomik RNT-də 3?²-poli(A) quyruğu və ya başqa oliqo (A) tərkibli ardıcıllıqdan istifadə edərək nsp7/8/nsp12-vasitəçili oliqouridilasiya üçün “primer” kimi istifadə edilə bilər. picornavirus VPg zülalı (44) üçün yaradılmış mexanizmə bənzər bir şablon kimi xidmət edir.Təklif “qeyri-normativ” olarsa nə etməli????(Zülal ilə induksiya olunan) mənfi zəncirli RNT sintezinin başlanması müşahidələrlə əlaqə yaradır ki, bu da koronavirusun mənfi zəncirli RNT-nin sonunda UMP (UTP əvəzinə) olduğunu göstərir (42), bu, nuklein turşusu Dicer naməlum uridinə spesifik endonükleaza ilə fosforlanmış ucunu parçalayır.Təsdiq olunarsa, bu nuklein turşusunun hidrolitik fəaliyyəti nsp9-un oliqomerik UMPylated formasını yaranan mənfi zəncirinin 5 ² ucundan azad etməyə kömək edə bilər.Nsp9-un zülalın hazırlanmasında mümkün rolu, nsp9 (və nsp8)-in koronavirus genomunun 3-cü ucunun yaxınlığında qorunan cis-fəaliyyət göstərən RNT elementi ilə kritik və spesifik olaraq qarşılıqlı əlaqədə olduğunu göstərən əvvəlki tərs genetik tədqiqatlarla da uyğundur.45).Bu hesabata görə, bu əvvəlki müşahidələr indi yenidən araşdırıla və əlavə tədqiqatlar vasitəsilə genişləndirilə bilər.
Xülasə, məlumatlarımız N-terminusda RdRp ilə əlaqəli xüsusi yuvalanmış virus ferment etiketinin spesifik fəaliyyətini müəyyən etdi.Koronavirusda bu yeni kəşf edilmiş NiRAN vasitəçiliyi ilə UMPylator/NMPylator fəaliyyəti Mn2+ və ona bitişik Asn qalıqlarına etibar etmək və N-terminal əsas amin ilə (aşağı enerjili) fosforamidat bağlarının əmələ gəlməsinə səbəb olmaq üçün istifadə olunur.Nsp8|9 parçalanma yerində Mpro vasitəçiliyi ilə parçalanma vasitəsilə nsp9 hədəfi RdRp-ə qədər uzanan proteaz və NiRAN domeni arasında funksional birləşməni göstərən NMPylation üçün istifadə edilə bilər.NSp12 NiRAN aktiv yerində və nsp9 hədəfində əsas qalıqların mühafizəsi, SARS-CoV-2 də daxil olmaqla iki koronavirusdan əldə edilən məlumatlar ilə birlikdə nsp9 NMPylation-ın bir koronavirus olduğuna dair güclü sübutlar təqdim edir.Mövcud məlumatlar bizi belə nəticəyə gətirir ki, nsp9-un NMPyated formasının zülalla törədilən RNT sintezində xüsusi rolu koronavirus və digər yuvalanmış viruslar üçün ağlabatan ssenaridir və NiRAN digər naməlum zülalları da hədəfə ala bilər.Virusu tənzimləyin.Ev sahibinin qarşılıqlı əlaqəsi.Təsdiq edilərsə, protein primerlərinin viral RNT sintezində iştirakı əvvəllər aşkar edilmiş koronavirus və indi yeni yaradılmış Pisoniviritlərdə birləşmiş pikornavirusa bənzər superqrup (9) arasında Mpro/3CLpro və RdRp domenlərinin ardıcıl yaxınlığını artıracaq 46) kateqoriyasında.
Məlumatlarımız həmçinin göstərir ki, bu işdə müəyyən edilmiş əsas, selektiv və konservativ ferment fəaliyyətləri antiviral dərmanlar üçün hədəf kimi istifadə edilə bilər.Konservləşdirilmiş nsp9 N-terminusunun NiRAN-ın aktiv yerində bağlanmasına (və sonradan modifikasiyasına) müdaxilə edən birləşmələr müxtəlif (alt) cins İnfeksiyalardan olan heyvan və insan koronaviruslarının müalicəsi üçün uyğun olan effektiv və çox yönlü antiviral dərmanlara çevrilə bilər. SARS-CoV-2 və Yaxın Şərq Tənəffüs Sindromu Koronavirusu da daxil olmaqla.
Bu tədqiqatda istehsal olunan koronavirus zülalının kodlaşdırma ardıcıllığı HCoV-229E ilə yoluxmuş Huh-7 və ya SARS-CoV-2 ilə yoluxmuş Vero E6-dan təcrid olunmuş RNT-dən istifadə edərək RT-PCR ilə gücləndirilmiş və standart klonlaşdırma prosedurlarından istifadə etməklə daxil edilmişdir.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) və ya pASK3-Ub-CHis6 (47) ifadə vektoru (SI Əlavəsi, Cədvəllər S1 və S2).Tək kodon əvəzetmələri PCR-əsaslı sahəyə yönəldilmiş mutagenez tərəfindən təqdim edilmişdir (48).MBP füzyon zülalını istehsal etmək üçün E. coli TB1 hüceyrələri müvafiq pMAL-c2 plazmid konstruksiyasına çevrildi (SI əlavəsi, Cədvəl S1).Füzyon zülalı amiloza yaxınlıq xromatoqrafiyası ilə təmizləndi və Xa faktoru ilə parçalandı.Daha sonra, C-terminal His6 işarəli zülal əvvəllər təsvir edildiyi kimi Ni-immobilizasiya edilmiş metal yaxınlıq xromatoqrafiyası (Ni-IMAC) ilə təmizləndi (49).Ubiquitin füzyon zülalını istehsal etmək üçün E. coli TB1 hüceyrələri müvafiq pASK3-Ub-CHis6 plazmid konstruksiyasından (SI Əlavəsi, Cədvəllər S1 və S2) və ubiquitin spesifik C-terminal hidrolaza 1-i (Ubp1) kodlayan pCGI plazmid DNT-dən istifadə etdi.Transformasiya (47).C-terminal His6 etiketli koronavirus zülalı əvvəllər təsvir edildiyi kimi təmizləndi (50).
HCoV-229E nsp12-His6-nın özünü NMPilasiya testi EAV nsp9 (16)-da təsvir olunduğu kimi aparılmışdır.Qısaca desək, nsp12-His6 (0,5 µM) tərkibində 50 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik turşu (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitol ( DTT), 6 mM MnCl2, µMffer2 var. göstərilən NTP və 0,17 µM [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) 30 °C-də 30 dəqiqə ərzində uyğunlaşdı.Nsp12-vasitəçili nsp9 NMPilasiyasının bütün digər (standart) NMPylation analizlərində reaksiya şərtləri aşağıdakı kimi tənzimlənir: nsp12-His6 (0.05 µM) və nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) mövcudluğunda ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM NTP-ni göstərdi və 0,17 µM [α32-P]NTP-yə uyğun gəldi.30°C-də 10 dəqiqə inkubasiya edildikdən sonra reaksiya nümunəsi SDS-PAGE nümunə tamponu ilə qarışdırıldı: 62,5 mM tris(hidroksimetil)aminometan HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% qliserin və 0,00% bromofenol mavi.Zülal 90 °C-də 5 dəqiqə qızdırılaraq denatürasiya edildi və 12% SDS-PAGE ilə ayrıldı.Gel bərkidilir və Coomassie Brilliant Blue məhlulu (40% metanol, 10% sirkə turşusu, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250) ilə boyanır, rəngsizləşdirilir və 20 saat ərzində fosforlu görüntüləmə ekranına məruz qalır (NMP-dən nsp12 aşkar etmək üçün) və ya (maksimum) 2 Saat (nsp9 NMPyasiyasını qiymətləndirmək üçün).Ekranı skan etmək üçün Typhoon 9200 təsvir cihazı (GE Healthcare) və siqnal intensivliyini təhlil etmək üçün ImageJ istifadə edilib.
MS analizi üçün NMPylation analizində 1 µM nsp12-His6 və 10 µM nsp9 (heksahistidin etiketi olmadan) istifadə edilmişdir (SI əlavəsi, Cədvəl S1) və 500 µM UTP və GTP-nin artan konsentrasiyası istifadə edilmişdir.Onların konsentrasiyası və gözlənilən zülal keyfiyyətindən asılı olaraq, 1-10 µL tamponlanmış protein məhlullarını onlayn olaraq duzsuzlaşdırmaq üçün MassPrep sütunu (Sular) ilə təchiz olunmuş Waters ACQUITY H-Class HPLC sistemi istifadə edilmişdir.Duzsuzlaşdırılmış zülal Synapt G2Si kütlə spektrometrinin (Sular) elektrosprey ion mənbəyinə A tamponunun (su/0,05% qarışqa turşusu) və B buferinin (asetonitril/0,045% qarışqa turşusu) aşağıdakı gradientindən keçir və sütunun temperaturu 60 ° C və 0,1 mL/dəq axın sürəti: 2 dəqiqə ərzində 5% A ilə izokratik olaraq elüsyon, sonra 8 dəqiqə ərzində 95% B-ə xətti gradient və 95% B-ni başqa 4 dəqiqə saxlayın.
Kütləvi diapazonu 500-dən 5000 m/z-ə qədər olan müsbət ionlar aşkar edilir.Qlu-fibrinopeptid B, kütlə sürüşməsinin avtomatik korreksiyası üçün hər 45 saniyədən bir ölçülür.Baza xətti çıxıldıqdan və hamarlandıqdan sonra orta spektri deconvolve etmək üçün MaxEnt1 genişləndirilməsi ilə MassLynx alət proqramından istifadə edin.
UMPylated HCoV-229E nsp9, ardıcıllıqla dəyişdirilmiş tripsin (Serva) əlavə edilərək həzm olundu və gecə ərzində 37 °C-də inkubasiya edildi.Peptidlərin duzsuzlaşdırılması və konsentrasiyası üçün Chromabond C18WP spin sütunundan (hissə nömrəsi 730522; Macherey-Nagel) istifadə edilmişdir.Nəhayət, peptid 5% asetonitril və 0,1% qarışqa turşusu olan 25 µL suda həll edildi.
Nümunələr Orbitrap Velos Pro kütlə spektrometrindən (Thermo Scientific) istifadə edərək MS tərəfindən təhlil edilmişdir.Son nanoâ HPLC sistemi (Dionex), xüsusi ucunda quraşdırılmış 50 sm ??2,4 μm maqnit muncuqlarla dolu 75 μm C18 RP sütunu (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Proxeon nanospray mənbəyi vasitəsilə onlayn olaraq kütlə spektrometrinə qoşulun;300 µm daxili diametrə 6 µL tripsin həzm məhlulu yeridin.1 sm C18 PepMap konsentrasiyadan əvvəl sütun (Thermo Scientific).Həlledici kimi su/0,05% qarışqa turşusundan istifadə edərək nümunə avtomatik olaraq tutuldu və 6 µL/dəq axın sürətində duzsuzlaşdırıldı.
300 nL/dəq axın sürətində triptik peptidlərin ayrılmasına nail olmaq üçün aşağıdakı su/0,05% qarışqa turşusu (həlledici A) və 80% asetonitril/0,045% qarışqa turşusu (həlledici B) istifadə edilmişdir: 4% B üçün 5 dəqiqə, sonra dəqiqə ərzində 45% B-ə qədər 30 A xətti gradient və 5 dəqiqə ərzində 95% həlledici B-yə xətti artım.Xromatoqrafik sütunu paslanmayan polad nano-emitterə (Proxeon) qoşun və 2300 V potensialdan istifadə edərək eluenti birbaşa kütlə spektrometrinin qızdırılan kapilyarına səpin. Orbitrap kütlə analizatorunda 60.000 ayırdetmə ilə sorğu skanı əlaqələndirilir. xətti ion tələsinin toqquşması nəticəsində yaranan dissosiasiya və ya orbitrap aşkarlanması ilə birləşmiş daha yüksək enerjili toqquşma dissosiasiyasından istifadə edərək, dinamik olaraq 30 saniyə ərzində xaric edilmiş ən azı üç məlumat MS/MS skanı, Qətnamə 7500-dür.
Göndərmə vaxtı: 03 avqust 2021-ci il